ImageJ实用技巧——自动细胞计数(解放双手篇)

操作视频-ImageJ自动细胞计数 https://www.zhihu.com/video/1166822620372144128

对于生物狗和密集恐惧症患者来说， 手动数细胞 是一个极其无聊以及耗费精力的工作。

扯远啦~上一篇为大家介绍了ImageJ的安装，以后的文章我会以 实际应用 的方式，解释ImageJ各种目录以及功能。

这是解放双手篇的第一篇——利用ImageJ实现自动细胞计数。我也会介绍一下多种细胞手动计数的方法。

利用ImageJ进行自动细胞计数的工作流程（Workflow）：

在进行自动细胞计数之前，如果你的图像是荧光图像（信号是亮的，背景是黑的），

需要对ImageJ进行初始设置 （Process -> Binary -> Options） ：

勾选Black background。

一、自动细胞计数

1、打开想要处理的图像（File-Open，或者将图片直接拖动到菜单栏）

我们的目标是：自动对DAPI染色的细胞核进行计数，得到细胞核的总数。

2、将图像转为8-bit（Image-Type-8-bit）

RGB格式简介： 一般彩色的荧光图片都是RGB格式的。RGB代表 红、绿、蓝 三种颜色，可以通过这 三种颜色的叠加 得到各式各样的颜色。

而RGB的每个通道各有 256级亮度 ，用数字表示为从0、1、2...直到255。在0时最弱，而在255最亮。

例如，纯红色的R值为255，G值为0，B值为0，即（255,0,0）。 灰色的R、G、B三个值是相等的（除了0和255）；黑色的R、G、B都为0,；白色的R、G、B都为255。

按照计算，256级的RGB色彩总共能组合出约1678万种色彩，即256×256×256=16777216。也称为24位色(2的24次方)。

当我们把一个RGB图像，转换为8-bit图像时，其实就是来了一个简单的缩放 。使用以下公式转换为灰度：

灰色=（红色+绿色+蓝色）/ 3

转换为8-bit之后，每个像素仅仅只有一个通道，有256级灰度，即0~255，表示亮度从深到浅，对应图像中的颜色为从黑到白。

注意：如果你的图像在保存时，已经保存成单通道了（8-bit,16-bit），不需要进行这一步。这一步是为了后面，设置Threshold。

16-bit的图像可以直接进行Threshold，不用转成8-bit，否则会有亮度信息的损失。

3、调整阈值，去除背景，选中细胞核（Image-Adjust-Threshold）

注意选择Red来进行表征 ，所以变为红色的区域就是已经选中的区域。

注意背景是黑的，所以要勾选Dark Background！

这时候可能需要进行两项操作：

（1）如果图像带有比例尺：拖动调节阈值的上限可以去除比例尺 （因为自动计数可能会把比例尺也当做细胞来统计）

（2）如果自动阈值效果不好：换拖动调节阈值的下限，可以增加选中区域 ，但要注意在选中细胞核的同时，尽可能少的减少背景。或者选择不同的自动阈值算法。

拖动完成后点击Apply ，图片转为非黑即白的二值化图片：

5、填补细胞核的空隙（Process-Binary-Fill Holes）

在调节阈值减少背景的同时，可能细胞核的一些不均匀部分也被减弱了，可以填补空隙，使得细胞核变成实心球形：

6、打断细胞核的重叠部分（Process-Binary-Watershed）

细胞密度比较大时，通常会有细胞重叠或者贴近的情况。可以利用Watershed自动识别重叠部分，并将两个细胞核分离开来：

7、自动分析、计数颗粒（Analyze-Analyze Particles）

出现Analyze Particles界面，通过不同的情况设置参数， 最重要的是红框中的参数 。

Size：300-Infinity——指分析颗粒面积大于300（一定注意这里的单位是pixel），一直到无穷大的颗粒。（ 根据细胞大小，以及结果好坏来更改 ）

Circularity：0.00-1.00——指圆度，可以根据细胞形状，调整需要的圆度，1.00为标准圆。

Exclude on edges——处于边缘的颗粒不计入

设置完成后，点击OK，即出现以下结果：

可以看到最后统计出的细胞核数为141，且每个细胞核的面积也在Results中显示出来。 可以放大检查原图中是否有多数或者漏数的细胞。

注意：自动计数并不是完全准确的，如果发现自动计数与实践明显出现偏差，出现多数或者漏数，需要优化阈值（Threshold）和颗粒尺寸的判断标准（Size以及Circularity）。并且形状无规则的细胞，例如神经细胞，不适于自动计数，需要手动计数，所以接下来介绍一下利用ImageJ进行手动细胞计数。

二、手动细胞计数

主要有两种方法：

1、Multi-point工具

双击可以更改点的形态、颜色和大小。使用的时候直接点击细胞，就会自动的标号。但对于多种细胞类型分别计数，并不是很便捷。

2、Cell Counter插件

这就显示出Fiji，相对于传统的ImageJ的优势了。 基本能用上的插件，都已经包含在程序中， 只需要搜索即可。例如我们在搜索框中输入：Cell，即可出现Cell Counter这个插件的选项。选中后，点击Run即可。

然后就会出现Cell Counter插件的界面，可以对多种细胞进行计数，并且在同一图像中显示出来。具体的应用其实非常简单，在这里就不再赘述了。

细胞自动计数和手动计数，大概介绍完了。如果想熟练掌握，可以随便百度一张红血球计数板的照片，按照上面的步骤一步一步操作即可。

如果对于ImageJ使用有什么问题可以私信我，或者给我发邮件：zhaoyc9@163.com

更多教程可以关注我的专栏：

希望对大家有帮助~